Las técnicas que se usan dependen de la pregunta diagnóstica. Entre ellas están NGS, PCR convencional, qPCR, PCR digital, análisis de fragmentos, estudios de clonalidad y análisis de quimerismo.
Extracción de DNA/RNA y síntesis de cDNA
Objetivo
Antes de cualquier estudio molecular hay que obtener, a partir de la muestra, ácidos nucleicos con calidad suficiente. Según el ensayo se extrae DNA, RNA o ambos.
El RNA es más inestable que el DNA y, para muchas aplicaciones, se convierte a cDNA por transcripción reversa. Esta estrategia es especialmente útil para estudiar transcritos de fusión y expresión génica.
Muestra
La fuente menciona sobre todo médula ósea y sangre periférica, aunque el material apropiado depende de la enfermedad y del ensayo. La cantidad y la calidad de las células neoplásicas de la muestra influyen directamente en la sensibilidad.
Fundamento técnico
Un esquema frecuente de extracción automatizada combina lisis celular con partículas magnéticas que capturan los ácidos nucleicos. Varios lavados eliminan proteínas y restos celulares, y al final se recupera el DNA o el RNA purificado para el análisis.
Cuando se trabaja con RNA, una transcriptasa reversa sintetiza cDNA. El cDNA no contiene intrones y es particularmente útil para detectar transcritos de fusión, porque sus puntos de ruptura genómicos son variables o se localizan en regiones muy amplias.
Secuenciación de nueva generación (NGS)
Utilidad
NGS analiza en paralelo múltiples regiones génicas. En hematología sirve para:
- detectar variantes en paneles de genes;
- construir perfiles moleculares al diagnóstico;
- apoyar clasificación y pronóstico;
- buscar mutaciones asociadas con resistencia;
- con determinados diseños, dar seguimiento a la enfermedad residual.
Muestra
El estudio puede hacerse con DNA o RNA de médula ósea, sangre periférica u otros materiales apropiados. La elección depende de la entidad, de la carga de enfermedad y del tipo de alteración que se busca.
Metodología
En el diagnóstico dirigido se emplean con frecuencia estrategias de amplicon deep sequencing o de captura y enriquecimiento de regiones seleccionadas. Estos abordajes permiten estudiar decenas o cientos de genes o hotspots en una sola corrida.
La sensibilidad depende del diseño del ensayo, de la profundidad de lectura, de la calidad de la muestra, de la cobertura de cada región y del pipeline bioinformático. Para algunos paneles dirigidos, la fuente describe sensibilidades aproximadas de 1–3% de carga de variante; ese valor no debe extrapolarse a todos los ensayos de NGS.
Los datos obtenidos requieren procesamiento bioinformático, anotación y revisión especializada antes de interpretarse en la clínica.
PCR convencional
Utilidad
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica una región específica de DNA o cDNA. Sirve, por ejemplo, para estudiar una secuencia diana o para detectar un transcrito de fusión cuando ya se conoce la región que hay que amplificar.
Principio
La PCR usa dos oligonucleótidos iniciadores (primers) que flanquean la región de interés y una DNA polimerasa termoestable. Cada ciclo incluye:
- desnaturalización, que separa las dos cadenas de DNA;
- alineamiento, en el que los primers se unen a sus secuencias complementarias;
- elongación, en la que la polimerasa sintetiza nuevas cadenas.
Al repetir estos ciclos, la secuencia diana se amplifica de manera exponencial. Después, el producto puede analizarse por electroforesis, por análisis capilar o por otra metodología.
Cuando la fusión se expresa como RNA, suele partirse del cDNA obtenido por transcripción reversa.
PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Utilidad
La qPCR detecta y cuantifica una secuencia mientras ocurre la amplificación. Su principal fortaleza en hematología es el seguimiento cuantitativo de marcadores moleculares bien definidos.
Metodología
Además de los primers, el ensayo puede incorporar sondas fluorescentes específicas. La fluorescencia aumenta a medida que se genera producto de PCR. El ciclo en el que la señal rebasa un umbral se relaciona con la cantidad inicial de la secuencia diana.
La cuantificación puede compararse con una curva estándar y normalizarse frente a un gen o transcrito de referencia. Según el blanco y el ensayo, la qPCR puede alcanzar sensibilidades muy altas —del orden de una célula o molécula neoplásica entre 10⁴–10⁵ equivalentes normales— en aplicaciones adecuadamente validadas.
La sensibilidad real debe determinarse en cada ensayo.
PCR digital (dPCR)
Utilidad
La PCR digital detecta y cuantifica una secuencia específica sin depender de una curva estándar convencional. Es útil cuando se necesita cuantificación absoluta o alta sensibilidad para variantes o marcadores ya definidos.
Principio
La mezcla de PCR se divide en miles de particiones pequeñas —por ejemplo, gotas en ddPCR— que contienen cero, una o varias copias de la secuencia diana. Después de la amplificación, cada partición se clasifica como positiva o negativa y un modelo estadístico estima la concentración inicial.
Para determinados blancos en su plataforma, la fuente describe sensibilidades aproximadas de entre 0.005% y 0.05%; ese rango depende del ensayo y no representa un límite universal de la tecnología.
Análisis de fragmentos
Utilidad
El análisis de fragmentos, también conocido como Genescan, separa por tamaño productos de PCR fluorescentes mediante electroforesis capilar. En condiciones apropiadas puede distinguir diferencias de tan sólo un par de bases.
Se utiliza para:
- inserciones y deleciones;
- duplicaciones;
- determinados rearreglos;
- cuantificación relativa de variantes;
- estudios de clonalidad;
- análisis de quimerismo.
Metodología
Uno de los primers de PCR se marca con un fluorocromo. Los productos amplificados se separan en un secuenciador capilar junto con un estándar interno de tamaño. Con distintos fluorocromos pueden analizarse varios blancos en un mismo ensayo multiplex.
Estudios de clonalidad
Fundamento
Durante la maduración normal de los linfocitos B y T ocurren rearreglos V(D)J en los genes de los receptores de antígeno. Una población linfoide normal es policlonal y tiene gran diversidad de rearreglos; una proliferación clonal puede producir uno o varios patrones dominantes.
El análisis molecular de clonalidad ayuda a documentar una población B o T dominante, pero clonalidad no equivale por sí sola a malignidad. Los procesos reactivos también pueden producir expansiones clonales o restringidas, así que el resultado debe interpretarse junto con la morfología, el inmunofenotipo y el contexto clínico.
Metodología
Los rearreglos V(D)J se amplifican por PCR multiplex con primers fluorescentes y los productos se separan por electroforesis capilar. El patrón de tamaños ayuda a diferenciar un fondo policlonal de una población dominante.
En algunos casos, un rearreglo específico documentado al diagnóstico puede usarse después como marcador de seguimiento con técnicas más sensibles.
Análisis de quimerismo
Utilidad
Después de un trasplante alogénico de células hematopoyéticas, el análisis de quimerismo cuantifica la contribución relativa de la hematopoyesis del donador y del receptor.
Se denomina:
- quimerismo completo cuando la hematopoyesis evaluada corresponde al donador;
- quimerismo mixto cuando coexisten células del donador y del receptor.
El seguimiento puede aportar información sobre injerto, pérdida del injerto o reaparición de hematopoyesis del receptor, aunque su significado depende de la enfermedad, del compartimento celular y del momento clínico.
Muestras
Para el seguimiento, la fuente describe médula ósea o sangre periférica y, como referencia inicial, material del paciente antes del trasplante y/o una muestra del donador. En determinadas estrategias también se usan como referencia tejidos no hematopoyéticos del receptor.
Metodología basada en STR
Una técnica clásica usa short tandem repeats (STR), regiones donde el número de repeticiones cortas varía entre individuos. Los loci STR se amplifican por PCR multiplex y se analizan por tamaño. Son informativos los marcadores que permiten distinguir los alelos del donador de los del receptor.
Al combinar varios loci se obtiene un perfil genético lo bastante discriminante para estimar el porcentaje de células de cada origen. Con su metodología convencional, la fuente reporta sensibilidades aproximadas de 2–5% en sangre o médula ósea total.
Integración de resultados
La técnica molecular debe elegirse a partir de una pregunta concreta. NGS es potente para perfiles multigénicos; PCR/qPCR y dPCR son especialmente útiles para blancos definidos y para seguimiento; el análisis de fragmentos resuelve aplicaciones específicas; y los estudios de clonalidad o de quimerismo responden preguntas biológicas diferentes.
Ninguna técnica debe interpretarse de forma aislada cuando la enfermedad exige integrar morfología, citometría, citogenética y contexto clínico.