El aumento de la capacidad de secuenciación hace posible estudiar desde regiones puntuales de un gen hasta porciones extensas del genoma. Por eso, una parte central de la bioinformática moderna consiste en desarrollar y aplicar algoritmos que identifiquen, anoten y prioricen las variantes con posible relevancia para el diagnóstico.
Flujo general de análisis
Los datos crudos de una corrida de secuenciación pasan por varias etapas antes de llegar a la interpretación diagnóstica:
- asignación de las lecturas a cada muestra;
- control y preprocesamiento de los datos;
- alineamiento contra un genoma de referencia;
- identificación de variantes;
- anotación molecular;
- filtrado y priorización;
- revisión e interpretación por personal especializado.
Preprocesamiento de datos
Al preparar las bibliotecas, cada muestra recibe un identificador molecular o barcode. Terminada la secuenciación, el demultiplexado usa esos identificadores para separar las lecturas y generar un archivo FASTQ por cada muestra.
Después, las lecturas se alinean contra la secuencia de referencia humana. El resultado del alineamiento suele guardarse en formatos como BAM/CRAM, que conservan la posición genómica de cada lectura y los demás parámetros necesarios para el análisis posterior.
En el diagnóstico dirigido no siempre se analiza el genoma completo. Muchas veces se estudian genes, exones o regiones elegidos por su relación con una enfermedad, con una profundidad de cobertura suficiente para detectar variantes presentes en subclones pequeños. La profundidad necesaria depende de la aplicación, del diseño del ensayo y de su validación analítica.
Identificación y anotación de variantes
Sobre los datos alineados se aplican algoritmos de detección de variantes que reconocen las diferencias respecto a la secuencia de referencia. Entre otras, pueden identificarse:
- variantes de un solo nucleótido (SNV);
- inserciones y deleciones pequeñas;
- según el ensayo y el pipeline, otros tipos de alteraciones estructurales o de número de copias.
La anotación le da contexto a cada hallazgo: gen afectado, región genómica, transcrito, consecuencia molecular, nomenclatura estandarizada y los datos disponibles sobre frecuencia, función o relevancia clínica.
La interpretación final exige separar las alteraciones potencialmente relevantes de las variantes benignas y los polimorfismos frecuentes. Para ello se integran bases de datos, literatura, conocimiento de la enfermedad, características del ensayo y, cuando existe, la evidencia que el propio laboratorio ha acumulado.
Principios de calidad
Un análisis bioinformático con fines diagnósticos debe ser trazable y reproducible. Su calidad depende, entre otros factores, de:
- la referencia y los transcritos utilizados;
- las versiones de software y de bases de datos;
- los parámetros de alineamiento y de llamado de variantes;
- la cobertura y la calidad de la secuenciación;
- los límites de detección validados;
- los filtros aplicados;
- la revisión humana de las variantes clínicamente relevantes.
La bioinformática es, entonces, parte integral del proceso diagnóstico y no una etapa aparte de la biología molecular ni de la interpretación clínica.